꿈의 기술 'CRISPR 유전자가위' 차세대 기술로 더욱 진보

CRISPR-Cas9 한계 극복위한 차세대 기술 연구 활발Cas9 단백질 최적화·Guide RNA 최적화·새로운 염기 편집 도구 개발·CRISPR-Cas9 응용

꿈의 기술 CRISPR-Cas9(크리스퍼 캐스9)의 단점을 보완한 차세대 유전자 편집 도구와 기술 개발이 활발히 진행되고 있다. 차세대 CRISPR는 높은 정확성을 바탕으로 사용 편의성, 생체 전달 안정성 향상을 주된 목적으로 하고 있어, 일상 기술로 다가올 날이 머지않은 것으로 보인다.

생물학연구정보센터(BRIC, Biological Research Information Center)는 지난 9일 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine) 한승엽 박사의 `CRISPR 이후 개발되는 염기 편집 도구들` 리포트를 발간했다.

뉴클리아제(Nuclease)에 의한 염기 편집 도구 시스템인 'CRISPR-Cas9'은 현재 의학 연구 및 치료, 유전 공학 및 농업 등, 다양한 분야에서 중요한 역할을 수행하고 있다.

특히 최근 단순한 유전자 편집 도구를 넘어 변형된 Cas9들을 이용한 응용은 유전자 발현의 조절, 유전체의 후성유전학적 편집, 염색체 분석 및 이미지 처리와 같은 유전 공학에까지 이용되고 있다.

한승엽 박사는 리포트를 통해 최근 CRISPR-Cas9을 업그레이드한 유전체 도구들의 현황과 CRISPR 이후에 개발되고 있는 염기 편집 도구들을 제시했다.

한승엽 박사의 리포트에 따르면 CRISPR는 기존 방법인 `TALEN/ZFN`보다 훨씬 방법적으로 간단하고, 특정 염기 서열을 지정할 수 있어, 그 사용 범위가 넓은 장점이 있다.

현재 사용되는 CRISPR 매개의 유전자 편집 기술은 짧은 단일 가이드 Sg(Single guided) RNA를 이용해 타깃 염기 서열을 특이적으로 인식하도록 하고, DNA 절단 활성이 조절 가능한 엔도뉴클레아제 Cas9으로 구성돼 있다. 특히 Cas9 단백질은 유전적으로 재설계가 용이해 현재 활발히 다양한 버전의 Cas9이 개발돼 사용되고 있다.

그러나 이러한 CRISPR의 강력한 장점과 편의성에도 불구하고 추가적인 연구에서 그 한계점이 드러나고 있다.

대표적으로 ▲오프타깃 효과(Off-Target Effect, 부정확한 영향) ▲표적 염기 이외에 다른 곳을 표적한 경우 ▲전체 유전체 내에서 표적 염기 서열의 제거 여부며, 이러한 불안정성의 기술이 사람에게 적용될 경우, 치명적으로 작용될 수 있어 추가적인 증명이 필요한 실정이다.

이에 따라 기존 CRISPR 단점을 개선한 차세대 염기 편집 도구들이 활발히 개발되고 있다.

한승엽 박사의 리포트에 따르면 먼저 CRISPR의 정확성을 높이기 위해 Cas9 단백질의 특성을 규명하고, 이를 재설계하려는 연구가 진행되고 있다. Cas9 단백질은 비교적 큰 사이즈로 AAV(Adeno-associated virus, 아데노 연관 바이러스)를 매개로 한 전달에서의 제한을 극복하기 위해 단백질 크기를 줄이려는 연구가 진행 중이다.

또한 기존 CRISPR의 가장 큰 문제점인 오프타깃 효과(off-target effect, 부정확한 영향)를 줄이기 위해 Cas9-sgRNA 복합체의 전달 방법이 고려되고 있다. 실제 두 개의 독립적인 플라스미드 기반 전달과 달리 Cas9-sgRNA를 리보뉴클레오타이드단백질(RNP) 복합체로 한 번에 전달하면 일시적으로 Cas9 활성이 높아지고 표적 외 효과가 줄어든다는 보고가 있다. 이에 따라 관련 연구가 진행되고 있다.

아울러 Cas9과 sgRNA 복합체의 시간적 및 공간적 활성을 제어하기 위해 소분자 화학물질, 빛 촉매 및 리간드 의존적 알로스테릭(Allosteric) 조절을 이용한 유도성 Cas9과 같은 방법들에 관한 연구도 진행 중이다.

다음으로 dead Cas9 (dCas9)의 활용이다. 유전자 발현을 특이적으로 조절하기 위해 Cas9의 절삭 기능이 제거된 dead Cas9 (dCas9)의 성질을 이용하며, 이는 dCas9 결합 활성이 전사 과정을 차단해 타깃 유전자 발현을 저하시키는 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 개발하는 데에 이용됐다.

또한 기존 TALEN과 ZFN의 장점을 극대화하는 연구도 진행 중이다. 기존 ZFN의 부정확성을 개선시키기 위해 Fok I 도메인을 징크 핑거 어레이(Zink Finger Array)의 N 또는 C 말단에 부착하고, 징크 핑거 사이에 염기 건너뛰기 링커 삽입해 정확성을 증가시키고자 한다. TALEN의 경우 각각 단일 염기쌍을 표적으로 하는 다양한 식물병원체에서 유래한 DNA 결합 모듈 어레이에 Fok I를 부착하는 방식으로 한계를 극복하고자 하는 움직임을 보이고 있다.

이어 DSB(Double Strand Breaks, 이중가닥절단)에 이은 HDR(Homology Directed Repair, 상동재조합)의 예측 불가능성을 줄이는 방법으로 편집하기 위해 SSR(Site-Specific Recombinases)에 대한 연구도 진행 중이다. 엔도뉴클레아제로 유도된 DSB는 유전자 편집에 있어 그 효율성을 증가시키는 중요한 발견이지만, 편집을 위해 DSB 이후 복구 작용인 HDR에 의존하면 삽입 결실 또는 염색체 전위가 발생할 위험이 큰 것으로 알려져 있다. 이에 대한 해결책으로 SSR이 관심을 받고 있다.

이외에도 ▲Cpf1-sticky end digestion ▲염기 C의 염기 T 치환 기술 ▲소규모의 Cas9(NmCas9, CjCas9, SaCas9, SpCas9 ▲캐스케이드(Cascade)와 Cas3 편집 기술 ▲Cas12- Cas12a, Cas12b, Cas12f1 ▲Cas13의 RNA 표적 ▲mini-Cas9 추출 ▲핵산가교(BNA) 합성 ▲Cas-CLOVER ▲IS200/IS605 transposon 등을 활용한 유전자 편집 기술이 활발하게 연구되고 있다.

한승엽 박사는 리포트를 통해 “CRISPR를 이용하거나 응용한 도구들은 전체 개체군이나 하나의 종을 대상으로 진행되고 있는 유전자 드라이브에 관련된 문제”라며 “이러한 응용법은 전체적인 생명체의 군집에 영향을 미칠 수 있는 문제이므로, 이에 대한 CRISPR의 지속성 및 안전성에 대한 고민이 필요하다”고 전했다.

이어 “현재까지는 주로 낮은 면역원성을 가진 AAV 벡터를 이용했는데, Cas 단백질의 크기가 비교적 크기 때문에 AAV 벡터로 패킹징하는데 어려움이 있다”라며 “이에 따라 기존 Cas 단백질의 크기를 줄이는 방향으로 연구가 진행되고 있으며, 같은 성능의 다양한 Cas 단백질을 찾고 있다”고 덧붙였다. 

또한 “이러한 과제들에도 불구하고, CRISPR의 발견과 이후 염기 편집 도구들은 향후의 DNA 및 RNA 편집 기술을 이용한 유전자, 세포 치료를 발전시킬 엄청난 잠재력을 가지고 있다”라며 향후 다가올 차세대 CRISPR 기술에 기대감을 나타냈다.